探针资本_行业研究：基于结构生物学的药物发现
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《基于结构生物学的药物发现》
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一、 冷冻电镜发展概述
1.1 冷冻电镜的发展历史
1.2 冷冻电镜在结构生物学的应用越发广泛
二、 冷冻电镜技术原理概述
2.1冷冻电镜的技术原理
2.2 冷冻电镜的操作与数据分析流程
2.3 冷冻电镜技术的主要种类
2.4 近年冷冻电镜的核心技术突破
三、 冷冻电镜当前在业界的主要应用
3.1 冷冻电镜在小分子药物研发中的应用
3.2 冷冻电镜在抗体类药物研发中的应用
四、 冷冻电镜的未来展望
4.1 对于小分子蛋白的分析
4.2 分辨率仍有很大提高空间
4.3 提高效率以满足业界产能需求
4.4 功能的多样化
一、冷冻电镜发展概述
1.1 冷冻电镜的发展历史
1931年，德国物理学家Ernst Ruska 发明了世界上第一台电子显微镜，不久之后物理学家Ladislaus Marton在一篇文章中评论道：“很不幸，这一新技术尚不能应用于生物材料的研究，因为持续的电子束冲击会无可挽回地损坏有机物样品。”同时电子显微镜在生物学的应用还需要解决包括样品厚度导致的多重衍射，生物样品在真空环境下失水，以及电子反应与温度变化导致的样品移动等其他问题。对此，他在文中提出了颇具远见的假想解决方案：新的样品制备方法，即冷冻需要研究的生物样本或使用类似负染色（negative staining）的技术。
在二十世纪四十年代到六十年代，研究人员们一直在尝试通过负染色将电镜技术应用于生物样品，主要方法为通过重金属盐包埋在样品表面形成一层外壳，以此提高样品对电子束冲击的抵御能力。然而使用电镜直接观察负染色得到的样品只适用于观察细菌、病毒与细胞器的2D形态学投影，而无法获得分子层面的高分辨率结构信息。
与此同时，其他研究人员也在寻求通过冷冻制备样品的途径。然而在慢速冷冻下，水会产生结晶，造成样品结构破坏与电子衍射，进而导致图像信息的缺失与模糊。直到上世纪八十年代，研究人员发现快速冷却微米级水滴可以使水跳过结晶而直接均一玻璃化。1981年，Jaques Dubochet 与Alasdair McDowall 基于这一发现研发了生物样品的快速冷冻制备技术。这一发明导致了冷冻电镜的诞生，使得人类直接观察生物大分子的自然结构与构象成为了可能。
1968年，Aaron Klug与David DeRosier首次通过傅立叶变换与逆变换，由电镜2D投影计算出了T4噬菌体尾巴的3D结构。这一发现获使Klug获得了1982年诺贝尔化学奖，并且时至今日，依旧是包括冷冻电镜在内所有电镜技术重构3D结构的基本原理。
上世纪七十年代中期，Richard Henderson与Nigel Unwin发明了不需要负染色的蛋白质晶体样品制备技术，他们利用葡萄糖溶液取代水来保持样品在真空中的完整性，并在系统性分析电子射线对样品损伤后将电子束强度下调至约1e-/Å2以减少电子射线带来的损失。1975年，Henderson使用该制备技术在室温下解析了细菌视紫红素（bacteriorhodopsin）的三维结构，这是人类第一次对膜蛋白的跨膜结构有了直观认识。在冷冻固定技术发明之后，Hendreson及其研究小组通过平均同一研究对象的大量分子获取的冷冻电镜图像，获得了细菌视紫红素基于2D晶体的高分辨率结构，证明了在快速冷冻条件下，电子损伤可以降低到足以保留蛋白质氨基酸侧链位置信息的水平。接下来的几年内，同一方法被用于解析包括水孔蛋白、微管蛋白二聚体和捕光复合物系统等复合物的高分辨率结构。五年后，Henderson发表了一篇量化分析论文，指出基于2D晶体的冷冻电镜分析需要校准并平均至少104个分子量大于50 kDa的分子以获取原子水平的分辨率（约3 Å）。随后几年在实验研究证明，获取这一分辨率实际需要的分子数量略小于Henderson的预测，而Glaeser发表了一篇分析指出分子量需求可以被降至约20 kDa。
在研究不能结晶的非对称分子时，由于样品只能以溶液形式制备，其面临的一个基本问题就是“如何校准在高噪音背景中模糊可见且方向随机的特征”。对于非晶体的单一组成样品，主要挑战为决定微粒的位置与朝向，即决定其2D位置与3D朝向的五个参数。然而生物样品在结构上很少具有单一性，且很可能包含杂质。因此对于生物样品的冷冻电镜分析，附加的需求包括发现统一分子的不同构象与发现非单一组成样品中的不同微粒。1981年，Joachim Frank与Marin van Heel发明了一种基于朝向与结构特征分类微粒图像的数学方法，之后在1986-1987年，Frank与Michael Radermacher发明了随机锥形倾斜（Random Conical Tilt），以此为基础将溶液中的2D图像投影重构至3D图像。Frank 发明了大量用于冷冻电镜图象分析的重要数学工具，构成了冷冻电镜单颗粒分析（Single Particle Analysis, SPA）的重要基础。
2017年，Dubochet、Henderson与Frank由于他们为冷冻电镜发展做出的重要贡献获颁诺贝尔化学奖，而在冷冻电镜的发展过程中，还有众多其他科学家也做出了重要贡献（图1）。尤其在近十年，科学家们取得了大量突破性发现，例如基于最大似然性的图像分类算法与直接电子探测器等，大大提高了冷冻电镜的效率与分辨率，为冷冻电镜在结构生物学领域的大范围应用奠定了坚实基础。
图1. 冷冻电镜发展中的重要发现与里程碑事件
1.2 冷冻电镜在结构生物学的应用越发广泛
结构生物学诞生于上世纪中期，是一门以探究生物大分子的结构与功能为手段来研究生命现象的学科。目前，在结构生物学领域主要应用的技术手段有三种，即X射线晶体学（X-ray crystallography, XRC）、核磁共振（nuclear magnetic resonane, NMR）与电子显微镜（electron microscopy, EM），三者共同构成了高分辨率结构生物学的基础。其中X射线晶体学最早诞生也最早得以广泛应用，而电子显微镜的应用比例则在近十年快速提升。如图2所示，截至2021年7月25日，在wwPDB数据库每年收录的生物大分子结构中，使用电子显微镜进行结构解析的比例自2015年起逐年快速上涨，其中绝大部分使用的是冷冻电镜（cryogenic electron microscopy, cryo-EM），这一现象背后的原因包括以下几点：
1. 冷冻电镜降低了样品本身性质与制备难度。X射线晶体学研究需要研究人员将蛋白质样品纯化结晶为一定量的高纯度高质量的蛋白质晶体，对晶体样品质量和数量都有很高的要求，且有很多生物大分子由于自身性质很难或无法结晶，对X射线晶体学适用的研究对象造成了很大限制。核磁共振则只适用于高度稳定的蛋白溶液，对于蛋白溶液浓度要求很高（通常在mM等级），对于溶解量小的生物大分子并不适用。而冷冻电镜技术不需要对样品进行结晶处理，可以直接对纯化后的少量样品进行分析，适用的研究对象范围也大大增加。
图2. wwPDB数据库每年收录的生物大分子结构使用的结构解析技术（柱状图）及使用电子显微镜解析的生物大分子结构所占比例（折线图）。（EM：电子显微镜；NMR：核磁共振；XRC：X射线晶体学；其他：荧光转移、红外光谱等）
数据来源：wwpdb生物大分子结构数据库
2. 冷冻电镜满足了科学研究对生物大分子处于自然状态的需求。XRC的结晶过程、传统电镜中对样本的重金属负染色处理与解析过程中的辐射影响都存在改变大分子自然折叠与构象的风险，而冷冻电镜的样品处理基于快速冷冻技术，能够最大程度保留生物大分子样本的自然结构，包括了蛋白质的翻译后修饰，能为后续机理研究及药物研发提供更多有用的线索。
3. 冷冻电镜的研究在近年接连取得技术突破。基于其样品的易于制备，科研人员长期致力于将电子显微镜应用于结构生物学，然而囿于电子辐射对生物大分子结构的破坏、传统电镜的低分辨率与只适用于研究大分子量对象等诸多限制，电镜在结构生物学的应用一直受到较大限制。直到近十年研究人员在电镜的样品制备、硬件与算法等方面取得大量突破性成就，冷冻电镜技术水平获得飞速提升，在保留样本自然结构的同时，分辨率逐渐被提升至3 Å以下（图3），结构重建的精度与效率也被新的算法显著提高，使其在结构生物学领域的应用率快速增加。
图3. 近十年被wwPDB数据库收录的通过电镜技术解析的生物大分子分辨率
数据来源：wwpdb生物大分子结构数据库
二、冷冻电镜技术原理概述
2.1 冷冻电镜的技术原理
冷冻电镜的基础技术原理可分为电子显微镜、冷冻包埋技术与3D结构重构三大部分。
图4. 穿透式电子显微镜基本结构示意图（左）与
电子光路图（右）
1. 电子显微镜：电子显微镜的基本原理与光学显微镜类似，但由于电子的波长远小于可见光，其分辨率可以达到光学显微镜的数个数量级以上。以目前最常见的穿透式电子显微镜为例，电子显微镜可分为光学系统、真空系统和高压电源三部分。其中光学系统为电镜的主体，可简化为一个三镜系统：物镜（objective lens）、中间透镜（intermediate lens）与投影透镜（projector lens）。如图4所示，电子由电子枪发送，在经过聚光镜（condenser lens）时，电子会被聚焦为细微连贯的电子束，并在聚焦光圈（condenser aperture）消除发射角度过高的电子。电子之后穿过样品，依照样品不同部位的厚度与电子吸收率不同，部分电子会被样品中较重的原子散射并通过物镜聚焦，经中间透镜调整图像与衍射的放大倍数后，最后由投影透镜放大信号冲击电子探测器，以此获得样品在这一截面的2D投影。其中物镜光圈（objective sperture）可以调整至中间透镜与物镜之间，以此获得特定视野范围内的高分辨率衍射图像。
2. 快速冷冻包埋制备样品：相较传统电镜，冷冻电镜在结构生物学领域得以应用的一大根本优势就在于快速冷冻包埋技术。这一技术在保证减免电子束冲击对生物样品造成损伤，保留绝大多数结构细节的同时，依托快速冷冻避免水分结晶，能够保持生物样品的自然结构与活性首先将水喷洒在负载样品的炭网格上，之后将网格置入由液氮保持在-190摄氏度的乙烷中快速冷冻，即可获取可供电镜观察的均一薄膜样品（图5）。
图5. 快速冷冻技术制备样品示意图
3. 3D结构重建：经由冷冻电镜获得的图像为电子投射方向上截面的2D投影，因此为了得到物体的确切3D结构，需要通过数学算法将2D校准重叠从而重建3D结构。这一算法的基础理论由Aaron Klug在1968年提出，其核心理论基于中央截面定理，即三维物体在某一方向投影的傅立叶变换，等于该物体垂直于该方向且过原点的截面（中央截面）的傅立叶变换。因此当对同一个物体在电镜下多个角度的2D投影进行傅立叶变换，即可得到该物体在这些方向上的中央截面的傅立叶变换，将之叠加之后再进行傅立叶逆变换，即可获得物体的3D结构（图6）。
图6. 以电子显微镜2D投影为基础重构3D结构示意图，
以“傅立叶鸭”为例。
2.2 冷冻电镜的操作与数据分析流程
实际操作中，冷冻电镜的操作流程可大至归纳为以下步骤：
1） 在开始冷冻电镜前，可通过负染电镜快速筛选均一样品；
2） 快速冷冻样品获取可供电镜分析的冷冻薄层样品；
3） 使用电镜从不同角度观察样品并获得大量2d图像；
4） 对不同颗粒在不同角度的2D图像进行分类校准，并进行对焦检测与衬度传递函数（CTF）纠正；
5） 校准颗粒在不同角度的2D投影，并通过傅立叶变换与逆傅立叶变换重建3D结构。
图6. 冷冻电镜基本数据分析流程，以单颗粒分析为例。
上：负染电镜；下：冷冻电镜
其中第4步与第5步为冷冻电镜的图像处理流程，如图6所示。其细分步骤如图7，主要包括：
1） 对焦检测与CTF修正获得优化后的微图像：这一步是为了优化冷冻电镜获得的原始图像以保留更多细节；
2） 筛选微粒：这一步可以分为人工筛选（manual picking）、受监督筛选（supervised picking）与自动筛选（automatic picking）几步，在保证完整细节与覆盖多个角度的前提下，排除杂质微粒的影响，为下一步2D分类与3D重构作准备；
图7. 冷冻电镜图像处理流程
3） 2D分类：将微粒按照种类、构象阶段与空间朝向分门别类并分别校准，获得同一微粒在不同状态下包含了最多细节的2D图像；
4） 3D重构：基于上文描述的算法，由同一微粒分类完成的2D图像完成3D结构的重建。
2.3 冷冻电镜技术的主要种类
冷冻电镜技术根据样品的不同，主要可以分为以下三种：
1. 冷冻电子晶体学（cryo-electron crystallography）
这一方法的研究者中，代表人物为上文提到的Richard Henderson与Nigel Unwin，其使用的样品为构成2D点阵的生物大分子晶体。由于晶体均一构成的特质，电子对晶体在不同方向获得的衍射点即为该方向上的傅立叶变换，之后对不同方向上的2D衍射图像进行校准叠加，再进行逆傅立叶变换即可获得研究对象的3D空间结构。相较XRC，由于物体对电子的衍射能力更强，电子晶体学所需要的样品晶体大小远远小于XRC，可以用少量样品获取高分辨率的结构。而近几年出现的连续旋转电子衍射技术，在保证分辨率的同时，能够记录更多方向上的衍射图像，在重建的结构中获取空间上的更多细节。
2. 单颗粒分析 (Single Partical Analysis, SPA)
大多数生物大分子无法以晶体方式存在，而只能以单独的形式存在，且对很多生物大分子，结晶非常难以达到，因此对于溶液中的生物大分子进行结构解析是非常有必要的，而解决这个问题的方法即为基于Joachim Frank团队数学算法的单颗粒分析。在单颗粒分析中，由于分子在溶液中进行随机运动，对于同一分子，可以同时获得各个朝向颗粒的2D投影，之后只需基于这些投影进行3D重构即可。
图8. 单颗粒分析中分子空间朝向的向量化表达。向量的每一维代表分子图像所具有的该像素强度，每一个三维向量分别代表一个不同朝向的颗粒。
然而要解析溶液中的分子结构，迫切需要解决的问题便是如何判定分子的朝向与位置。Frank对于这一问题提出了一个对图像中的分子进行分类的数学方法，在这一方法中，每一个颗粒的图像都被抽取进行单独分析，对于n个不同强度的像素构成的颗粒，可以用一个n维向量进行抽象表示（图8），之后对这些向量进行多变量聚类，即可将图像中的颗粒进行分类。每一类中的颗粒即代表该同一构象的同一分子在同一朝向的2D投影，如此即可获得分子在各个方向的2D投影。
单颗粒分析不需要结晶便可完成结构解析，且具有高分辨率（可达原子级），生物样品受辐射量小于是损失较小，和尤其对于大分子量的生物大分子与复合物表现尤其出色等优点，但也对样品中结构的重复性有非常苛刻的要求，只能用于解析纯度很高的生物大分子结构。
3. 冷冻电子断层成像（cryo-electron tomography）
在实际的结构生物学研究中，许多研究对象的结构其实并不均一（如细胞器、细胞、带膜病毒等），因此不能通过电子晶体学或单颗粒分析的方法进行研究。其基本原理为将初步纯化的研究对象直接进行快速冷冻处理并通过电镜在各个角度成像，之后再利用多方向上的2D投影进行3D结构重建（图9）。
图9. 电子断层成像的基本原理: a) 对物体在不同方向进行投影；b) 对不同方向上的投影进行汇总与3D重构
由于电子断层成像的研究对象多为形态较为多元且颗粒较大的生物结构（细胞器等），其对于样品质量的要求远小于电子晶体学（需要结晶）与单颗粒分析（需要高纯度溶液）。但也因此在对样品同一位置反复拍照时，样品所受的总辐射量也更大，受到的辐射孙商业更多。且由于样品体积大小，其倾转角度受到样品部分厚度的限制，有部分信息丢失的风险。
2.4 近年冷冻电镜的核心技术突破
在冷冻电镜技术发明以来，其在结构生物学领域虽有所应用，但依然十分受限。其限制主要体现在分辨率较低、只能用于研究大分子量样品与电子显微镜性能不足等各方面。这一状况直到近十年科学家们在图像处理算法和硬件研究上取得了突破性成果方才有所改变，尤其在2012年，直接电子探测器和基于最大似然度的图像分类算法得以广泛运用，冷冻电镜在硬软件各方面的不足得到了明显弥补，尤其在分辨率上有非常明显的提升，使用冷冻电镜解析的原子级分辨率生物大分子结构在2015年之后大量涌现（图2）。
1. 基于最大似然度的图像分类算法（RELION）
在单颗粒分析中，制约分辨率的一大因素就是分子构象的差异性。在同一溶液中，即使是均一的分子，各颗粒间在构象和配体结合状态上仍有较大差异，经过空间结构重构中的平均算法，在关键位点的分辨率很难提高至原子级别。
针对这一问题，剑桥大学的Sjors Sheres团队在2012年发明了一种基于最大似然度的图像分类算法RELION（REgularised LIkelihoodOptimisatioN），用于对冷冻电镜重建的3D结构或2D投影进行自动分类优化。简单描述，这一算法基于通过对当前数据与之前积累的先验信息进行贝叶斯最大后验（Maximum a posteriori, MAP）似然度估计，从冷冻电镜重建的3D结构中选取有最高正确可能性的结构，而非直接对所有3D结构进行平均。
图10. 基于最大后验似然度算法的模型迭代分类选取示意图
在这一算法中，3D结构选取可以看作选取具有特征集ϴ的结构，使其在观察到的数据X与该分子先验信息Y条件下的似然度P（ϴ|X, Y）最大，在基于期望最大化算法（expectation-maximization algorithm）对后验似然度P（ϴ|X, Y）进行迭代优化后，获得使P（ϴ|X, Y）最大的结构特征集ϴ，进而推算出在该特征集下的分子3D结构，即为所求的最优结构（图10）。
此外RELION使用了快速傅立叶-空间插值（fast Fourier-space interpolation）、适应性期望最大化（adaptive expectation-maximization）和本地朝向搜寻（local orientational searches）来提高计算速度，基于信噪比优化模型精确度，并基于FSC曲线来防止算法的过拟合，使这一程序可以高效精确地获取最有可能的3D空间模型，从图像算法上极大提高了冷冻电镜的分辨率与效率。
2. 直接电子探测器（Direct Detection Device, DDD）
另一大大提高冷冻电镜分辨率的突破性发现就是直接电子探测器（DDD）取代电荷耦合器件（CCD）相机进行最后的成像。
在传统的电镜中，通过CCD相机进行最后的成像时并不能直接记录电子信息，而要先从电子信号转化为光信号，光信号通过光纤传递到探测器基地再转为电信号，二次光电转换会引入大量噪音，且由于转换中的高能量损失，需要很高的电子量才能达成，而高电子量会提高样品的辐射损失，极大影响最终成像的精度和分辨率。而DDD中，电子与PN结直接结合产生电子-空穴对，迁移至探测器基地后直接转变为电信号，能量转换损失极小，使利用低剂量电子束分析生物大分子结构成为可能，并减低了能量转换中引入的噪音，从而提高了冷冻电镜成像的分辨率。
2012年，UCSF的两位科学家David Agard和程亦凡在nature methods发表文章，证明DDD在冷冻电镜中可以极大提高分辨率和成像速度，从而使原子层面分辨率的“录像”成为可能。自此之后，随着DDD相机的推广，冷冻电镜在结构生物学领域的适用性又一次大大提高。
三、冷冻电镜当前在业界的主要应用
冷冻电镜作为一门新兴的技术，在学术界的应用主要集中在解析未知的生物大分子结构和构象，从而结合分子生物学、细胞生物学等领域的研究揭示生物现象背后的机理，为生命与生理现象提供分子水平的解释。而目前在业界，冷冻电镜的应用领域主要集中于阐述小分子药物和抗体类药物与靶点蛋白结合的机理。
3.1 冷冻电镜在小分子药物研发中的应用
冷冻电镜在小分子药物研发中的应用主要是通过观察小分子药物与靶点蛋白的结合方式，分析靶点蛋白的有效结合位点和小分子药物的有效基团。
以瑞德西韦（Remdesivir）和苏拉明（Suramin）与新冠病毒的RNA复制酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）的结合构象为例。在当前的冷冻电镜下，这两类药物与新冠病毒RdRP结合以后的构象已经可以达到2.5 Å，可以观察到瑞德西韦与苏拉明分别与新冠病毒RdRP的结合位点和作用机理。瑞德西韦通过替代核苷酸来阻断病毒复制中的病毒RNA延伸（图11），而两个分子的苏拉明与RdRP的结合会形成完全阻断RNA延伸的空间位置（图12），从而达成更好的阻断病毒RNA复制，抑制病毒在体内繁殖的作用。这一发现解释了苏拉明在体外能够起到更彻底的阻断新冠病毒RNA复制这一现象，同时可以为后续的抗新冠小分子药物设计提供结构与机理上的线索。
图11. 冷冻电镜观察所得瑞德西韦与新冠病毒RdRP的结合构象（上）与结合位点示意图（下）
图12. 冷冻电镜观察所得苏拉明与新冠病毒RdRP的结合构象（a）与示意图（b）
3.2 冷冻电镜在抗体类药物研发中的应用
以单克隆抗体为代表的大分子药物现在在临床研发中处于极其重要的地位，在肿瘤、传染病与内分泌疾病的治疗中具有很大潜力。而不同的抗体类药物针对同一靶点可以有完全不同的结合位点，不同的抗体类药物也可能互相之间作用形成增强效应，在临床应用中不同的抗体类药物联合用药与通过将不同抗体相连获得多特异性抗体都具有广泛的应用前景。尤其对于多特异性抗体，临床研究表明，通过连接不同单克隆抗体形成的双特异性抗体，针对HIV的临床疗效相较单一用药可以提高二至三倍。而在这类新型多特异性抗体类药物的研发中，基于冷冻电镜所观察到的抗体与靶点蛋白的结合位点与构象，可以为不同的抗体药物连接的设计明确方向。
以针对HER-2蛋白的两个单克隆抗体药物Trastuzumab与Pertuzumab为例。HER-2为人表皮生长因子受体2（Human Epidermal growth factor Recepter-2），其过度表达与乳腺癌有明显相关性。Trastuzumab与Pertuzumab通过与HER-2的结合，诱导免疫细胞对肿瘤细胞进行杀灭，从而达到清除肿瘤细胞，抑制癌症发展的效果。在临床用药中，Trastuzumab与Pertuzumab通常通过联合用药以提升药效，通过冷冻电镜观察得知，Trastuzumab和Pertuzumab在HER-2上的结合位点相隔甚远（图13）。基于这一发现，可知在设计Trastuzumab和Pertuzumab的双特异性抗体时，连接二者Fc结构域的铰链需要设计得更为灵活或增添一段蛋白linker，从而能够同时结合相距较远的位点。
图13. 冷冻电镜观察下Trastuzumab和Pertuzumab与HER-2同时结合的空间结构
四、冷冻电镜的未来展望
冷冻电镜发展至今，已经获得了长足的发展与广泛应用，而在未来也仍有很多值得期待的提高方向：
4.1 对于小分子蛋白的分析
目前冷冻电镜对蛋白的结构解析依然主要停留在50 kDa以上，若分子量再小则会出现分辨率不足与图像稳定性不佳的问题。这一问题需要未来研发出更好的相位板与图像处理算法来解决；
4.2 分辨率仍有很大提高空间
虽然现在已经解析了大量分辨率在3 Å以下的生物大分子结构，但将分辨率进一步稳定提升至2 Å以下，达到亚原子分辨率，目前仍然是需要努力的目标。为了达到分辨率的提高，有潜力的研究方向主要包括更先进的3D校准与分类技术、优化样品网格的制备、数据获取与处理。同时在硬件上，直接电子探测器的升级、更好性能的相位板与更先进的光学系统的研发都能讲分辨率提升到一个新的高度。
4.3 提高效率以满足业界产能需求
虽然有研究说明冷冻电镜距离成为药物研发的传统技术仍需要五至十年，但对于药厂与生物技术企业，现在正是开始将冷冻电镜整合进入生产线的最好时间。为了能够达到业界生产的产能需求，冷冻电镜的效率仍有较大提升空间。相较于目前业界常用的XRC，虽然冷冻电镜拥有更广泛的可研究对象范围，但是XRC的数据收集只需要几分钟且结构分析也非常迅速，而冷冻电镜的数据收集通常需要数小时甚至数天，因此冷冻电镜在产业上的应用需要实现堪比晶体学分析的通量，尤其是实现样品制备的自动化与流程优化。
4.4 功能的多样化
除开性能上的提高，冷冻电镜在功能性上也仍有很多可能性。目前冷冻电镜能够观察的对象仍是经过纯化固定之后的生物大分子，只能观察静态的分子结构，而未来一个值的关注的方向就是通过与其他高分辨率显微镜关联以观察研究对象在生物学功能不同阶段的动态，如与荧光显微镜关联，通过荧光标记，在原子水平观察分子在反应过程不同阶段的结构变化，为药物研发提供更多值的参考的信息。另一个拥有巨大应用潜力的方向则是高分辨率原位电镜，通过发展能够稳定细胞内部环境的样品制备方法，实现细胞环境下生物分子的结构和相互作用的原子级分辨率解析。
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